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1. rna合成cdna的流程？

1、rna合成cdna的流程？

制备互补DNA，往往需要先分离从目的基因转录来的mRNA.如果该基因编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此基因的产物是总mRNA的主要组成部分。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖**白体，如果用特异抗体结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。

在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用免疫沉淀或聚丙烯酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。合成步骤

1．cDNA第一链的合成 所有合成cDNA第一链的方***都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤**纯化到的禽类成髓细胞**（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病**反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病**（MLV）反转录酶。AMV反转录酶包括2个具有若干种酶活性的多肽***基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA-RNA杂交体的RNA部分进行内切降解（RNA酶H活性）。

MLV反转录酶只有单个多肽***基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA杂交体中的RNA的能力较弱。且其热稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反转录酶和MI。V反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH、最适盐浓度和最适温度各不相同．所以合成第一链时相应调整条件是非常重要的。

AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3’端poly（A）结合的12～18个核苷酸长的oligo（dT）。

2．cDNA第二链的合成 cDNA第二链的合成方***有以下几种：

（1）自身引导***。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成***较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方***很少使用。

cDNA合成

（2）置换合成***。该方***利用第一链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。

从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶工的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点：①非常有效；②直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。

3．cDNA合成技术 以Riboclone M-MLV CDNA合成技术为例。

Riboclone M—MLV cDNA合成系统***用M—MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取***AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成***用置换合成***，***用RNaseH和DNA聚合酶I进行置换合成，最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端，方***简便易行。其基本步骤为先合成第一链：

（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和适当引物，每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接头，用0.3ug），用HO调整体积至15ul，70℃处理5min冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入：

5X第一链缓冲液5ul。

RNasinRNA酶抑制剂25U

M—MLV（H）反转录酶200U

H2O调至总体积25ul

（2）用手指轻弹管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2~5ulCi[α一P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

（3）37℃（随机引物）或42℃（其他引物）保温1h。

（4）取出置于冰上。

（5）掺入测定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA终止反应，并使总体积为100ul。可取90ul进行电泳分析（先用苯酚抽提）。另l0ul进行同位素掺入放射性活性测定。

（6）第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成。

以上25ul反应总体积中所用RNA量为1ug，如合成5ugRNA，则可按比例扩大反应体积。倒5ugRNA使用125uL总体积进行合成。

第一链合成后再进行第二链合成：

（1）取第一链反应液20uL，再依次加入：

10X第二链缓冲液20uL

DNA聚合酶123ul。

RNaseH0.8ul

H2O加至终体积为100/uL

（2）轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2～5uLCi[α一P]dCTP。

（3）14℃温浴2h（如需合成长于3kb的cDNA，则需延长至3～4h）。

（4）掺入测定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul进行同位素掺入放射性测定．余下的可进行电泳分析。

（5）将cDNA第二链合成的反应液70℃处理10min，低速离心后置于冰上。

（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃温育10min。

（7）加入10uL 200mmol/L EDTA终止反应。

（8）用等体积苯酚：氯仿抽提cDNA反应液，离心2min。

（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍体积的7.5mol/l醋酸铵（或0.1倍体积的1.5mol/L醋酸钠，pH5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇（一20℃），一20℃放置30min后离心5min。

（10）小心丢去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，离心2min。

（11）小心移去上清液，干燥沉淀。

（12）沉淀溶于10～20ul TE缓冲液。

操作步骤是先加RNA、OligodT、随即引物、水

65C反应10min,冰上放置5min后：这一步是让RNA变性，把RNA的二级结构打开；

再加dNTP，RNaseA，BUFFER, MTV逆转录酶，

反应25℃10min：这一步是让反转录引物（oligodT，随机引物）和模板RNA退火结合

37℃60min：这一步是反转录酶的工作温度

70℃10min：这一步是变性，把合成的cDNA和RNA变性开，就拿到单链的cDNA

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